細(xì)胞凍存液作為凍存細(xì)胞時(shí)的液體環(huán)境,給細(xì)胞提供著營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用,可使冰點(diǎn)降低,提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞,防止或減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷,使細(xì)胞暫時(shí)脫離生長(zhǎng)狀態(tài)而將其細(xì)胞特性保存起來(lái),在需要時(shí)直接復(fù)蘇就可恢復(fù)細(xì)胞活性。傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液是使用培養(yǎng)基、血清和DMSO按照一定的比例混合,因其中的血清成分復(fù)雜、批次差異大等缺點(diǎn),其應(yīng)用具有局限性,且需要采用程序性降溫的凍存方法,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
無(wú)血清非程序細(xì)胞凍存液(無(wú)酚紅)化學(xué)成分明確,含有糖類、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及DMSO等多種保護(hù)劑,大大降低了在凍存過(guò)程中冰晶對(duì)于細(xì)胞的損傷,有效提高細(xì)胞復(fù)蘇率和活力;不含血清成分,減少了外源因子和污染源,更加安全、穩(wěn)定;同時(shí)省去繁瑣費(fèi)時(shí)的程序性降溫過(guò)程,可直接重懸細(xì)胞后置于-80℃保存,次日轉(zhuǎn)移到液氮中。
無(wú)血清非程序細(xì)胞凍存液 (無(wú)酚紅) 高效、安全、穩(wěn)定、操作便捷,與傳統(tǒng)細(xì)胞凍存液相比具有明顯優(yōu)勢(shì)(表1),推薦用于常規(guī)哺乳動(dòng)物細(xì)胞(包括腫瘤或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、原代細(xì)胞、干細(xì)胞、免疫細(xì)胞等)的凍存,尤其適合無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞凍存。因本產(chǎn)品不含酚紅,所以也適用于激素相關(guān)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的凍存。按照一般情況凍存1管細(xì)胞使用1mL凍存液計(jì)算,本產(chǎn)品可以用于大約100管細(xì)胞的凍存。
?表1：傳統(tǒng)細(xì)胞凍存液和耐思無(wú)血清非程序細(xì)胞凍存液(無(wú)酚紅)的特點(diǎn)比較
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?使用方法
??(一) 細(xì)胞凍存：
【凍存前,請(qǐng)確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期】
1.貼壁細(xì)胞制備細(xì)胞懸液：(懸浮細(xì)胞請(qǐng)忽略此步驟)
(1) 將舊培養(yǎng)基吸除,用PBS清洗兩遍。
(2) 在培養(yǎng)瓶中加入少許胰酶,以能覆滿瓶底為限。將培養(yǎng)瓶平置于培養(yǎng)箱中消化約1~2分鐘,期間在顯微鏡下觀察,一旦發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞變圓、比較松動(dòng)后,立即終止消化(個(gè)別難消化細(xì)胞需要延長(zhǎng)消化時(shí)間,但要避免消化過(guò)度)。
(3) 加入適量溫浴好的完全培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打均勻細(xì)胞。
2.貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的凍存：
(1) 取少量細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù),算出細(xì)胞總數(shù)和所需細(xì)胞凍存液的量。細(xì)胞的凍存密度以1×10^6~2×10^7 cells/ mL為宜。
(2) 將所需量的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至適當(dāng)離心管中,200~500×g,離心3-5分鐘, 棄上清收集細(xì)胞。(離心速度和時(shí)間取決于細(xì)胞類型)
(3) 向細(xì)胞沉淀中加入適量無(wú)血清非程序細(xì)胞凍存液,用移液器輕輕吹打以重懸細(xì)胞,分裝于無(wú)菌細(xì)胞凍存管中,嚴(yán)密封口后,注明細(xì)胞名稱、代數(shù)、日期。
(4) 直接置于-80℃冰箱中儲(chǔ)存,細(xì)胞可至少保存一年;或者-80℃過(guò)夜后,次日將細(xì)胞投入液氮中長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
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(二) 細(xì)胞復(fù)蘇：
1. 自液氮罐或-80℃冰箱中取出凍存管,檢查蓋子是否旋緊,立即放入37℃水浴中快速解凍。(避免冰晶重新結(jié)晶而造成細(xì)胞死亡),輕搖凍存管使其在1~2分鐘內(nèi)全部融化,以75%酒精擦拭凍存管外部,移入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。
2. 將解凍的細(xì)胞懸液移至15mL無(wú)菌離心管中,再加入5~10mL預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基,輕輕混合均勻,200~500×g,離心3-5分鐘,棄上清收集細(xì)胞。(離心速度和時(shí)間取決于細(xì)胞類型)
3. 加入預(yù)熱好的完全培養(yǎng)基,混合均勻,轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
?注意事項(xiàng)
1. 凍存過(guò)程中,在將凍存液加入到細(xì)胞之后,請(qǐng)盡量在冰袋附近操作,因?yàn)榈蜏乜梢员苊獗Ｗo(hù)劑對(duì)細(xì)胞造成損傷。
2. 請(qǐng)保證細(xì)胞凍存管完全密封,避免在復(fù)蘇過(guò)程中凍存管炸裂。
3. 理論上,本產(chǎn)品適用于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的凍存,但因細(xì)胞系種類繁多,無(wú)法逐一驗(yàn)證,因此我們推薦您在第一次使用本產(chǎn)品之前,事先對(duì)所凍存的細(xì)胞進(jìn)行至少為期1周的試驗(yàn)性細(xì)胞 凍存復(fù)蘇培養(yǎng),確認(rèn)性能后再進(jìn)行正式凍存。
4. 本產(chǎn)品為無(wú)菌包裝,無(wú)需過(guò)濾,請(qǐng)注意無(wú)菌取用。
5. 為了您的安全和健康, 操作時(shí)請(qǐng)穿著實(shí)驗(yàn)服并佩戴一次性手套。
